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涉及CRISPR和Cas9的基因编辑方法已经被广泛应用到各种各样的研究中，从切除人类基因组中的HIV到关闭灵长类动物的基因。 |
图片来源：维基百科，DCRJSR
涉及CRISPR和Cas9的基因编辑方法已经被广泛应用到各种各样的研究中，从切除人类基因组中的HIV到关闭灵长类动物的基因。发表于2014年8月5日的《Genome Research》的一项研究中，研究人员利用CRISPR/ Cas9改写一种人类细胞系的突变基因，该基因突变能够导致一种称为β地中海贫血的血液疾病。
“这是基因编辑用于纠正致病突变的进步，”波士顿儿童医院和哈佛医学院保罗·施密特说(没有参与这项研究)。不过，他补充说，有一些障碍“需要克服，才可以在临床上使用。”
β-地中海贫血是由HBB基因突变引起的，造成了严重的血红蛋白不足。据估计，全球100,000个人中就有一个受到影响，包括欧洲万分之一。患者需要输血，有可能会引起铁超载，这个并发症也需要治疗。一些研究人员正在针对有问题的基因开发一种基因治疗，但到目前为止还没有治愈的方法。
此图片描述了来源于特定病人的皮肤细胞的具有HBB基因突变的血细胞的纠正。图片来源：Fei Xie，加州大学旧金山分校
加州大学旧金山分校的Yuet Kan和他的同事转向CRISPR，看看是否可以用它来重写错误的遗传密码。研究人员首先从β-地中海贫血患者的皮肤成纤维细胞产生诱导多能干细胞(iPS细胞)。然后，他们设计了CRISPR/ Cas9结构来引导纠正HBB特殊位点的DNA序列，并且切割双链DNA。然后，细胞自身会通过同源重组用正确的核苷酸序列修正DNA。
Kan的研究团队将CRISPR/ Cas9与一个名为piggyBac的转座子结合，这允许该研究组能够将同源重组的一个标记插入其中。“我们证实某些克隆发生同源重组之后，我们可以用转座酶去除piggyBac转座子，”Kan说。根据这个方法，研究人员能够监测标记无需删除情况下的细胞对治疗的反应。
“令人兴奋的是，CRISPR技术和piggyBac转座子系统的结合，能够实现无痕基因校正，”佐治亚理工学院蛋白质工程核心设施的负责人T.J. Cradick说。Cradick以前与Kan合作过，但并没有参与这项研究。
继HBB基因突变的校正，Kan的研究团队将iPS细胞分化为造血祖细胞和红细胞，以衡量其β-球蛋白的生产水平。他们发现，β-球蛋白的mRNA水平增加了16倍，但在细胞中很少产生成人血红蛋白。 “我们还没有达到治疗水平呢，”Kan说。
“重要的是这些细胞保持多能性，但缺乏脱靶效应，”Cradick说。使用CRISPR的一种顾虑是，它具有切除基因组中其他非预期位点的可能性。Kan 补充道，至少在小鼠模型中，仍不知道iPSCs的移植是否有效果，因此，传送系统就必须进行优化。
虽然对确定基因编辑是否可以为β-地中海贫血提供一种治疗方式，没有经过大量的研究，Kan表示，但纠正缺陷基因表明，“这里有一条小路。”
原文摘要：
Fei Xie, Lin Ye, Judy C. Chang, Ashley I. Beyer, Jiaming Wang,Marcus O. Muench and Yuet Wai Kan
β-thalassemia, one of the most common genetic diseases worldwide, is caused by mutations in the human hemoglobin beta (HBB) gene. Creation ofhuman induced pluripotent stem cells (iPSCs) from β-thalassemia patients could offer an approach to cure this disease. Correction of the disease-causing mutations in iPSCs could restore normal function and provide a rich source of cells for transplantation. In this study, we used the latest gene-editing tool, CRISPR/Cas9 technology, combined with the piggyBactransposon to efficiently correct the HBB mutations in patient-derived iPSCswithout leaving any residual footprint. No off-target effects were detected in the corrected iPSCs, and the cells retain full pluripotency and exhibit normal karyotypes. When differentiated into erythroblasts using a monolayer culture,gene-corrected iPSCs restored expression of HBB compared to the parentaliPSCs line. Our study provides an effective approach to correct HBB mutationswithout leaving any genetic footprint in patient-derived iPSCs, thereby demonstrating a critical step toward the future application of stem cell-basedgene therapy to monogenic diseases.